Meten van de activiteiten van Cas-eiwitten geschikt voor plantpathogeen biosensoren

CRISPR/Cas werd in 2012 ontdekt als een bacterieel afweersysteem dat specifieke sequenties van virussen die bacteriën infecteren herkent en vervolgens onschadelijk maakt. Vrijwel direct na deze ontdekking werd de inzetbaarheid van CRISPR/Cas in biologisch en medisch onderzoek gedemonstreerd. Voor dit baanbrekend onderzoek aan CRISPR/Cas kregen de Amerikaanse moleculair biologe Jennifer Doudna en haar Franse collega Emmanuelle Charpentier al in 2020 de Nobelprijs. CRISPR/Cas heeft inmiddels gezorgd voor een revolutie in het bewerken, repareren en reguleren van DNA-sequenties (oftewel gene-editing) in bacteriën, planten en zelfs mensen. Daarnaast is recent gebleken dat Cas-eiwitten (onderdeel van CRISPR/Cas) ook kunnen worden ingezet voor de detectie van specifieke DNA-sequenties in voedsel, patiënten en gewassen. Deze Cas-eiwitten kunnen bijvoorbeeld worden ingezet voor de detectie van plant-pathogenen.
Detectiemethoden van b.v. pathogenen in voedsel moeten zeer gevoelig, specifiek, goedkoop en draagbaar zijn. Biosensoren kunnen deze eigenschappen combineren. Biosensoren zijn detectiesystemen die gebaseerd zijn op biologische componenten/processen zoals de hier beschreven Cas-eiwitten. Om bestaande en nog te ontwikkelen Cas-eiwitten te optimaliseren is een beter begrip van hun werking een vereiste. Momenteel worden nieuwe varianten van Cas-eiwitten via in silico modeleringen ontworpen. De potentie van deze varianten om door te ontwikkelen voor gebruik in biosensoren is echter afhankelijk van een gedegen en systematische analyse van hun in vitro activiteiten. In dit project wordt daarom samen met MKB-partner Spark Genetics (ontwikkelaar van biosensoren) onderzoek gedaan naar met welke nieuw te ontwikkelen analysemethode(n) de activiteit en specificiteit van Cas-eiwitten snel en kosteneffectief bepaald kan worden.
Avans en Spark Genetics kunnen direct profiteren van de resultaten van dit onderzoek. Zo is er voor Spark Genetics een directe vertaling van de resultaten naar het inzetten van de meest optimale Cas-eiwitten in nieuwe biosensoren en zal Avans hogeschool de kennis van de analysetechnieken direct integreren in haar laboratoriumonderwijs.

Eindrapportage

CRISPR/Cas werd in 2012 ontdekt als een bacterieel afweersysteem dat specifieke sequenties van virussen die bacteriën infecteren herkent en vervolgens onschadelijk maakt. Vrijwel direct na deze ontdekking werd de inzetbaarheid van CRISPR/Cas in biologisch en medisch onderzoek gedemonstreerd. CRISPR/Cas heeft inmiddels gezorgd voor een revolutie in het bewerken, repareren en reguleren van DNA-sequenties in bacteriën, planten en zelfs mensen. Daarnaast is recent gebleken dat Cas-eiwitten (onderdeel van CRISPR/Cas) ook kunnen worden ingezet voor de detectie van specifieke DNA-sequenties in voedsel, patiënten en gewassen, waaronder de detectie van plant-pathogenen. Om bestaande en nog te ontwikkelen Cas-eiwitten te optimaliseren is een beter begrip van hun werking een vereiste. Momenteel worden nieuwe varianten van Cas-eiwitten via in silico modeleringen ontworpen. De potentie van deze varianten om door te ontwikkelen voor gebruik in biosensoren is echter afhankelijk van een gedegen en systematische analyse van hun in vitro activiteiten. In dit project werd daarom samen met MKB-partner Spark Genetics (ontwikkelaar van biosensoren) onderzoek gedaan naar met welke nieuw te ontwikkelen analysemethode(n) de activiteit en specificiteit van Cas-eiwitten bepaald kan worden. Er werd een in vitro-assay opgezet en geoptimaliseerd voor het detecteren van Cis- en Trans-cleavage van Cas12a. De Trans-cleavage-activiteit werd in real-time gemeten met fluorescerende (hydrolyse)probes en de Cis-cleavage-activiteit werd zowel via eindpuntanalyse op agarose-gel als met fluorescerende probes in real-time gemeten. De experimenten lieten zien dat er verschil gemeten kon worden tussen een Cas12a mutant enzym in vergelijking met het wildtype Cas12a. Verder kon de ontwikkelde methode snel omgezet worden naar verschillende targets en waren de experimenten door meerdere analisten uitvoerbaar. Hiermee werden de doelen beantwoord om een prototype van een methode om de activiteiten van Cas-eiwitten in het laboratorium te meten op te zetten en “proof of concept” te geven voor een methodologie voor een universeel toepasbare ‘platform’-methode om varianten van Cas-eiwitten te meten.